​1. Επαγόμενη από ηλεκτρόνια θραυσματοποίηση πεπτιδίων

Για την μελέτη του μηχανισμού διάσπασης πεπτιδίων (bottom-up approach) μελετήθηκαν μια σειρά από πεπτίδια του ανθρώπινου λευκοκυτταρικού αντιγόνου (HLA) τάξης Ι. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι σε συγκεκριμένες περιπτώσεις ότι η νέα αυτή μέθοδος διάσπασης (EID – electron induced dissociation) μπορεί να παρέχει αυξημένη αλληλουχική κάλυψη συγκριτικά με τη θραυσματοποίηση προκαλούμενη από συγκρούσεις με αδρανή άτομα, καθώς και ότι οι δυο μέθοδοι μπορούν να λειτουργούν συμπληρωματικά, αυξάνοντας το ποσοστό αναγώρισης μορίων.

​

2. Οργανολογία
Ένα φασματόμετρο μάζας Q-Exactive τροποποιήθηκε για να συνδεθεί η πλατφόρμα omnitrap που επιτρέπει την πραγματοποίηση πειραμάτων διάσπασης επαγόμενης από ηλεκτρόνια (EID). Τα δεδομένα EID συγκρίνονται με αυτά από τη διάσπαση μέσω σύγκρουσης με αδρανή άτομα σε υψηλότερες ενέργειες (HCD).

​

3. Πειραματικός Σχεδιασμός & Αποτελέσματα
Ο άμεσος ψεκασμός του μείγματος συνθετικών πεπτιδίων HLA τάξης Ι με ροή 250 nL/min πραγματοποιήθηκε σε QExactive Plus αναβαθμισμένο με την πλατφόρμα Omnitrap για την πραγματοποίηση πειραμάτων HCD και EID. Για το HCD πείραμα, το πρόδρομο ιόν επιλέχθηκε στο τετραπολικό φίλτρο μαζών και η θραυσματοποιήθηκε με την κανονικοποιημένη τιμή της ενέργειας στο 25, που αντιστοιχεί περίπου σε 25eV. Για το EID πείραμα, απομονώθηκε το πρόδρομο ιόν στο τετραπολικό φίλτρο μάζας, και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η διάσπαση στο επιμέρους τμήμα Q5 του omnitrap χρησιμοποιώντας ηλεκτρόνια με κινητική ενέργεια   ̴15EV. Τα προϊόντα διάσπασης μεταφέρθηκαν πίσω στο QExactive μέσω του κελιού HCD για την καταγραφή του φάσματος μάζας (m/z).

Η θραυσματοποίηση είναι σχεδόν πλήρης και στις δύο περιπτώσεις. Με την EID τεχνική παράγονται επιπλέον d, w ιόντα για τα πεπτίδια με αργινίνη, καθώς και x ιόντα. 

Γενικότερα, το φαινόμενο του μετα-ιονισμού από ηλεκτρονία παρατηρήθηκε μόνο σε πειράματα EID μονοφορτισμένων πρόδρομων ιόντων και ο οποίος οδηγεί σε σχηματισμό πεπτιδικών ριζών που χαρακτηρίζονται από την απουσία ενός ατόμου υδρογόνου. Παρατηρήθηκαν επίσης και χαρακτηριστικά μονοπάτια θραυσματοποίησης κατευθυνόμενα από ρίζες. Η πλήρης ανάλυση των δεδομένων αποτελεί αντικείμενο μελέτης και θα παρουσιαστεί στην συνέχεια του προγράμματος, προσφέροντας μια πολύ χρήσιμη βάση για την βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών διάσπασης με ενεργητικά ηλεκτρόνια. Η ολοκλήρωση της μελέτης EID των πεπτιδίων HLA θα περιέχει επισης προτεινόμενες δομές μορίων-θραυσμάτων. 

Με την ολοκλήρωση της μελέτης και των δέκα HLA πεπτιδίων, αναμένεται ότι η συνδυασμένη χρήση των Q-Exactive – Omnitrap για τα πειράματα EID σε βελτιστοποιημένες συνθήκες η οποία θα συνεισφέρει σημαντικά στην αναγνώριση της πεπτιδικής αλληλουχίας, ενώ η δυνατότητα δημιουργίας θραυσμάτων με απώλεια πλευρικής αλυσίδας αποτελεί ένα επιπρόσθετο πλεονέκτημα στην αναγνώριση των αμινοξέων.

 

4. Ανάλυση άθικτων πρωτεϊνών στην πλατφόρμα Omnitrap

Παράλληλα με τις μετρήσεις bottom-up, πραγματοποιήθηκε και μια σειρά από πειράματα διάσπασης άθικτων (intact) πρωτεϊνών με ηλεκτρόνια διαφορετικών ενεργειών. Πιο συγκεκριμένα, διασπάστηκε η πρωτεϊνη ουμπικουιτίνη με 12 πρωτόνια-φορτία χρησιμοποιώντας ηλεκτρόνια χαμηλής ενέργειας (Electron Capture Dossiciation – ECD) καθώς και ενεργητικά ηλεκτρόνια (EID). Η ανάλυση του φάσματος μάζας σε ένα πείραμα top-down είναι ιδιαίτερα απαιτητική και για τον λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν ειδικά λογισμικά καθώς και μη-αυτοματοποιημένη ανάλυση των δεδομένων για την μείωση του σφάλματος στην αναγνώριση των πεπτιδίων-θραυσμάτων που παράγονται κατά την διαδικασία διάσπασης. Στα πειράματα ECD παρατηρήθηκαν όλων των ειδών τα βασικά θραυσμάτα καθώς και δευτερογενή θράυσματα χαμηλότερης έντασης που χαρακτηρίζονται από απώλειες πλευρικής αλυσίδας. 

​

​

​

​

Ένα φασματόμετρο μάζας Q-Exactive τροποποιήθηκε για να συνδεθεί η αναβαθμισμένη πλατφόρμα omnitrap που επιτρέπει την πραγματοποίηση πειραμάτων διάσπασης επαγόμενης από ηλεκτρόνια (ExD, x=I,D). Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις με πεπτίδια χαμηλού μοριακού βάρους και περιορισμένου αριθμού φορτίων για την βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών διάσπασης EID. Τα αρχικά αποτελέσματα αναδεικνύουν πως η τεχνική EID μπορεί να προσφέρει συμπληρωματική πληροφορία σχετικά με την αλληλουχική κάλυψη σε σχέση με μεθόδους θραυσματοποίησης που βασίζονται σε συγκρούσεις με αδρανή αέρια. Η πιθανή εφαρμογή της τεχνολογίας σε πειράματα bottom-up μπορεί να αυξήσει σημαντικά το ποσοστό των αναγνωρίσεων σε συνδυασμό με υγρή χρωματογραφία. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις top-down χρησιμοποιώντας άθικτες πρωτείνες. Κατόπιν ενδελεχούς ανάλυσης των φασμάτων μάζας γίνονται πλέον αντιληπτές οι δυνατότητες της τεχνολογίας omnitrap για μια πιο ολοκληρωμένη εφαρμογή της top-down προσέγγισης σε βιοαναλυτικά προβλήματα, όπως αυτό της ΧΝΝ.

 

​