IIBEAA

Επιλογή των βέλτιστων πεπτιδίων αναφοράς με MALDI και Orbitrap, καθώς και με τη δημιουργία πρότυπων καμπυλών για MRM

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ

1. Επιλογή πεπτιδίων για LC-MRM-MS

Με βάση προηγούμενη μελέτη μας (Glorieux et al.) [1], ο αρχικός στόχος ήταν η αξιολόγηση 39 πρωτεϊνών οι οποίες ήταν διαφορικά εκφραζόμενες μεταξύ ασθενών (Χρόνιας Νεφρικής Νόσου) ΧΝΝ σταδίου 2-3 (Ν = 14) σε σχέση με ασθενείς ΧΝΝ σταδίου 5 με αιμοδιάλυση (Ν = 15).
Για τις συγκεκριμένες πρωτεϊνες-πιθανούς βιοδείκτες επιλέχθησαν πρωτεοτυπικά πεπτίδια (4-7 για κάθε πρωτεΐνη) με βάση τα παρακάτω κριτήρια: (i) έλεγχος ποιότητας του φάσματος MS/MS για κάθε πεπτίδιο σε βιβλιοθήκη φασμάτων από ανθρώπινα δείγματα, (ii) αξιολόγηση χρωματογραφικών ιδιοτήτων που παρέχεται από το PeptideAtlas (http://www.peptideatlas.org) [2] και (iii) ποιότητα και αναπαραγωγιμότητητα των φασμάτων MS/MS του πρότυπου πεπτιδίου (SIS- Stable Isotope Labeled Standard) σε κινητή φάση Α (3 τεχνικά αντίγραφα), καθώς και των φασμάτων SIS όσο και του ενδογενούς πεπτιδίου (ΝΑΤ- endogenous or native) σε φυσιολογικό πλάσμα (3 τεχνικά αντίγραφα) και σε αντιπροσωπευτικά δείγματα ασθενών με ΧΝΝ (στάδια ΧΝΝ 2-5/Ν=2 ανά κατηγορία). Για κάθε πεπτίδιο επιλέχθηκαν προς ποσοτικοποίηση 2-3 θραύσματα με το βέλτιστο χρωματογραφικό πρότυπο. Σε όλες τις περιπτώσεις SIS χρησιμοποιήθηκε βαρέο ισότοπο (13C και 15N) το οποίο ενσωματώθηκε σε κατάλοιπα Λυσίνης (K) ή Αργινίνης (R), (Thermo Scientific).

2. Φασματομετρία μάζας MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry)

Για την εύρεση του ποσοστού καθαρότητας των 6 SIS πεπτιδίων που επιλέχθηκαν, 1 μL του κάθε δείγματος τοποθετήθηκε στο πλακίδιο ανάλυσης του MALDI μαζί με 1 μL διαλύματος μητρικής ουσίας (0,75% ACCA, 50% Ακετονιτρίλιο, 0,1% TFA) αφού πρώτα αραιώθηκε 1:10 με διάλυμα μητρικής ουσίας. Η ανάλυση των πεπτιδίων έγινε μέσω MALDI-TOF/TOF MS (Autoflex, Bruker Daltonics). Η λίστα μονοϊσοτοπικών κορυφών μετά από επεξεργασία του φάσματος, δημιουργήθηκε με το λογισμικό Flexanalysis v2.2 software (Bruker), η εξομάλυνση έγινε με τον αλγόριθμο Savitzky-Golay (πλάτος 0,2 m/z, αριθμός επαναλήψεων και το ελάχιστο όριο σήματος προς θόρυβο ήταν μεγαλύτερο από 2,5 (S/N > 2,5).

3. Προετοιμασία δειγμάτων για πρότυπη καμπύλη

Ίσος όγκος (2 μL) δειγμάτων πλάσματος (4 δειγμάτα ΧΝΝ σταδίου 1, 2, 3, 4) που περιείχαν 100 𝜇g συνολικής πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση LC-MRM-MS όπως έχει ήδη περιγραφεί από την ομάδα μας [3]. Εν συντομία, μετά την αναγωγή (διθειοερυθριτόλη 10 mM) και αλκυλίωση (ιωδοακεταμίδιο 50 mM) τα δείγματα θρυψινοποιήθηκαν [(1:100 ένζυμο : πρωτεΐνη (β/β)] για 16 ώρες στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Προς απομάκρυνση προσμίξεων, το πεπτιδικό μείγμα υπέστη εκχύλιση στερεάς φάσης με zip-tips (Thermo Scientific) και τα πεπτίδια αποξηράνθηκαν σε φυγόκεντρο υπό κενό. Στη συνέχεια, τα πεπτίδια διαλυτοποιήθηκαν σε κινητή φάση Α (97.9% H2Ο, 2% ακετονιτρίλιο, 0.1% μυρμηκικό οξύ), pH 3.5 σε τελική συγκέντρωση 0.5 𝜇g/𝜇L. Μείγμα των SIS πεπτιδίων προστέθηκε σε κάθε δείγμα.

4. Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση μεθόδου με LC-MRM-MS

Η υγρή χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε σε σύστημα, συζευγμένο με αναλυτική στήλη C18 (75 μm × 150 mm, μέγεθος σωματιδίων 5 μm, μέγεθος πόρων 100 Å) (Thermo Scientific). Ο διαχωρισμός και η έκλουση των πεπτιδίων επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία διαχωρισμού 60 λεπτών 2–72% κινητής φάσης B (80% ακετονιτρίλιο ο/ο, 0.1% μυρμηκικό οξύ, 19.9% Η2Ο) με ρυθμό ροής 300 nL/min. Τα δείγματα ενέθηκαν στο σύστημα LC και διαχωρίστηκαν στη στήλη C18. Τα θρυψινοποιημένα πεπτίδια αναλύθηκαν στο AB Sciex 4000QTRAP με πηγή ηλεκτροψεκασμού, ελεγχόμενη από το πρόγραμμα Analyst 1.5 software (AB Sciex). Ο φασματογράφος μάζας (υπό λειτουργία ΜRM), στο πρώτο και στο τρίτο τετράπολο (Q1, Q3) είχε διακριτική ικανότητα 0.7 Da). Οι βέλτιστες ενέργειες θραυσματοποίησης (collision energies) για κάθε πεπτιδικό θραύσμα υπολογίστηκαν αυτόματα από το λογισμικό Skyline [4].

5. Πρότυπη καμπύλη
Η πρότυπη καμπύλη είναι απαραίτητη για τη δημιουργία ενός κατάλληλου μείγματος πεπτιδίων (προτύπων και ενδογενών) έτσι ώστε ο λόγος SIS/NAT να κυμαίνεται από 0.1-10 για μεγαλύτερη ακρίβεια στην ποσοτικοποίηση [5-7]. Επιπλέον, η πρότυπη καμπύλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε δείγματα για την απόλυτη ποσοτικοποίηση του ενδογενούς πεπτιδίου. Συγκεκριμένα, η πρότυπη καμπύλη πραγματοποιήθηκε σε 3 τεχνικά αντίγραφα ΧΝΝ σταδίων 2-5. Το μείγμα SIS-πεπτιδίων με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση αραιώθηκε διαδοχικά και ενέθηκε στο θρυψινοποιημένο πλάσμα (δυναμικό εύρος αραιώσεων 1:64). Τα δείγματα αναλύθηκαν με LC-MRM-MS όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης, το εμβαδόν του πεπτιδικού θραύσματος με την υψηλότερη ένταση (τόσο για το ΝΑΤ όσο και για το SIS), μετρήθηκε με το Skyline [4]. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης (Linear regression analysis) όπου κάθε πρωτεοτυπικό πεπτίδιο χαρακτηρίστηκε από μια μοναδική εξίσωση της ακόλουθης μορφής: SIS/NAT = (m × [SIS]) + b, όπου m ορίζεται η κλίση της ευθείας και b ορίζεται το σημείο τομής του άξονα y με την καμπύλη.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

1. Επιλογή πρωτεοτυπικών πεπτιδίων
Από τις 39 πρωτεΐνες οι οποίες ήταν ενδιαφέρουσες ως πιθανοί βιοδείκτες της ΧΝΝ (Glorieux et al.) [1], οι 31 διέθεταν πρωτεοτυπικά πεπτίδια σύμφωνα με το Skyline. Με βάση αυτές τις πληροφορίες, ελήφθησαν 39 SIS πεπτίδια που αντιστοιχούσαν σε 31 πρωτεΐνες (1 πρωτεοτυπικό πεπτίδιο ανά πρωτεϊνη πλην των ΤFAM, B2M, PRPF3, LYZ, CNNM4, ITPR1, LENG8 και PTGDS με 2 πρωτεοτυπικά πεπτίδια για την κάθε μία). Τα 39 SIS πεπτίδια μετρήθηκαν σε κινητή φάση Α (3 τεχνικά αντίγραφα) σε υβριδικό φασματογράφο (τριπλό τετράπολο). Με βάση αυτό το πείραμα, αποκλείστηκαν τα 15 πεπτίδια λόγω φασματογραφικού προφίλ χαμηλής ποιότητας ή πολύ χαμηλής έντασης. Εν συνεχεία, τα υπόλοιπα 24 SIS πεπτίδια που εντοπίστηκαν με καλή ποιότητα στην κινητή φάση Α, μετρήθηκαν σε αντιπροσωπευτικά δείγματα πλάσματος (3 τεχνικά αντίγραφα φυσιολογικού πλάσματος). Στην συγκεκριμένη περίπτωση, τόσο το σήμα του SIS όσο και του NAT μετρήθηκε. Τέσσερα πεπτίδια απορρίφθηκαν λόγω κακής ποιότητας στο φάσμα του SIS. Εν συνεχεία, τα υπόλοιπα 20 πρωτεοτυπικά πεπτίδια αναλύθηκαν σε αντιπροσωπευτικά δείγματα ανά κατηγορία (στάδια ΧΝΝ 2-5/Ν=2 ανά κατηγορία). Από τα 20 πεπτίδια, 14 απορρίφθηκαν λόγω κακής χρωματογραφικής ποιότητας του ενδογενούς πεπτιδίου-ΝΑΤ στo πλάσμα. Επομένως 6 πρωτεοτυπικά πεπτίδια που αντιστοιχούσαν σε 6 πρωτεΐνες επιλέχτηκαν για περαιτέρω αναλυτικό έλεγχο. Tα παραπάνω πεπτίδια παρουσίαζαν εξαιρετικά και πανομοιότυπα χρωματογραφικά προφίλ τόσο στο ενδογενές ΝΑΤ όσο και στο SIS (ταυτόχρονη έκλουση SIS και NAT καθώς και συμμετρικά σχήματα κορυφής). Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται στο στο συνημμενο αρχείο στο τέλος της σελίδας.

2. Εκτίμηση καθαρότητας πεπτιδίων με MALDI-TOF MS

Με τη βοήθεια της μεθοδολογίας ΜALDI-TOF MS εκτιμήθηκε η καθαρότητα των 6 συνθετικών πεπτιδίων αναφοράς SIS για τις 6 επιλεγόμενες πρωτεΐνες στόχους (IGHA1, HBB, SERPINF1, AMBP, B2M, LYZ).

3. Δημιουργία πρότυπων καμπυλών για τα πεπτίδια SIS και ακρίβεια μεθόδου

Το R2 των πρότυπων καμπυλών ήταν > 0.99 για όλα τα πεπτίδια, εκτός από την Β2Μ που ήταν > 0.97.

H εκτίμηση της ακρίβειας της ποσοτικοποίησης πραγματοποίηθηκε σε όλα τα σημεία της καμπύλης και στα περισσότερα τα CVs ήταν <20% σύμφωνα με τα κριτήρια του FDA [8]. Συνοπτικά, λόγω διαθεσιμότητας πρωτεοτυπικών πεπτιδίων αναφοράς καθώς και ανιχνευσιμότητας του βαρέου προτύπου (SIS-Stable Isotope Labeled Standard) ή του ενδογενούς (NAT-endogenous or native) πεπτιδίου καταλήξαμε σε 6 πεπτίδια που αντιστοιχούν σε 6 πρωτεΐνες.

4. Ποσοτικοποίηση σε αντιπροσωπευτικά δείγματα ΧΝΝ

Στην συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ποσοτικοποίηση σε αντιπροσωπευτικά δείγματα ΧΝΝ (Ν=8) διαφορετικών σταδίων (ΧΝΝ σταδίου 2 Ν=2, XNN σταδίου 3 Ν=2, XNN σταδίου 4 Ν=2, ΧΝΝ σταδίου 5 Ν=2). Η συγκέντρωση του SIS πεπτιδίου που προστέθηκε σε κάθε δείγμα επιλέχθηκε βάση δημοσιευμένων ποσοτήτων των αντίστοιχων πρωτεινών. Σε κάθε περίπτωση το εύρος των τιμών που μετρήθηκαν ήταν εντός των ορίων της καμπύλης.