ΙΜΒΒ - ΙΤΕ

 

Επιλογή των βέλτιστων πρωτεϊνών αναφοράς, με Orbitrap και Omnitrap, καθώς και με τη δημιουργία πρότυπων καμπυλών για m-ELISA

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ

Το υλικό αναφοράς αποτελείται από 39 SIS πεπτίδια που αντιστοιχούν σε 31 πρωτεΐνες (1 πρωτεοτυπικό πεπτίδιο ανά πρωτεϊνη πλην των ΤFAM, B2M, PRPF3, LYZ, CNNM4, ITPR1, LENG8 και PTGDS με 2 πρωτεοτυπικά πεπτίδια για την κάθε μία). Για την ανάλυση αυτού του πεπτιδικού μείγματος  χρησιμοποιήθηκε σύστημα υγρής χρωματογραφίας νανό-ροής υψηλής ευκρίνειας συζευγμένης μέσω ηλεκτροψεκασμού με υβριδική φασματομετρία μάζας υψηλής ευκρίνειας, ευαισθησίας και ταχύτητας (nLC-ESI-LTQ-Orbitrap). Διαδοχικές ποσότητες από το πεπτιδικό μείγμα αναλύθηκαν στην πλατφόρμα nLC-ESI-LTQ-Orbitrap από 5pgr εως 240pgr διαλυτοποημένα σε υδατικό διάλυμα 0,05% Φορμικό οξύ (FA). Η υγρή χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε σε σύστημα Easy nLC (Thermo Scientific) με στήλη ανάστροφης φάσης (ReprosilPur C18 AQ, particle size = 3μm, pore size = 120Å - Dr. Maisch), 50cm (fused silica emitters, 75μm internal diameter - Thermo Scientific), ιδιοκατασκευής, με την χρήση συστήματος πακεταρίσματος υπό-πίεση  (Loader kit SP035, Proxeon). Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν με γραμμική βαθμίδωση νερού – ακετονιτριλίου με 0.05% FA, διάρκειας 145 λεπτών, με ροή 300 nL/min και εισήχθησαν σε φασματόμετρο μάζας nESI-LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific).

Στο Orbitrap (OT) συλλέχθηκαν φάσματα MS στο εύρος 300 - 2,000 m/z με ευκρίνεια (resolution) 60,000, ενώ φάσματα MS/MS συλλέχθηκαν στον τετραπολικό αναλυτή (quadrupole - Q) με παράθυρο επιλογής μητρικού ιόντος στα 1.6 m/z. Τα 20 υψηλότερης έντασης ιόντα (Top20) επιλέχθησαν από κάθε φάσμα MS για θραυσματοποίηση με high energy collision induced dissociation (HCD). Ο δυναμικός αποκλεισμός των μητρικών ιόντων που επιλέχθησαν για θραυσματοποίηση τέθηκε στα 20s με 10ppm ανοχή απόκλισης από το μητρικό ιόν.

Τα nLC-MS/MS δεδομένα επεξεργάστηκαν με το λογισμικό Proteome Discoverer 2.3 (Thermo Scientific) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο SEQUEST HT για την αναζήτηση στην πρωτεϊνική βάση δεδομένων Homo Sapiens_05_11_18.fasta που περιέχει το πιο ενημερωμένο ανθρώπινο θεωρητικό πρωτεΐνωμα.

 

 

 

 

Από τα 39 SIS πεπτίδια  του πεπτιδικού μείγματος ταυτοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν με αξιόπιστα δεδομένα τα 20 (Πίνακας ) που αντιστοιχούν σε  17 πρωτεϊνες (Πίνακας 12). Τα υπόλοιπα 19 πεπτίδια δεν ταυτοποιήθηκαν από το λογισμικό και σε χειροκίνητη αναζήτηση βρέθηκαν κάποια από αυτά σε πολύ μικρά ίχνη τα οποία δεν είναι αξιόπιστα για χρήση ως πεπτίδια αναφοράς.

Πίνακας 1: Λίστα πεπτιδίων που ταυτοποιήθηκαν αξιόπιστα από την ανάλυση με nLC-ESI-LTQ-Orbitrap.

 

 

Πίνακας 2: Λίστα πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν αξιόπιστα από την ανάλυση με nLC-ESI-LTQ-Orbitrap

 

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Follow

©2020 by www.m-elisa.org/ Proudly created with Wix.com

This site was designed with the
.com
website builder. Create your website today.
Start Now