Μεθοδολογία Υλοποίησης
Για την επίτευξη των στόχων του προτεινόμενου έργου θα χρησιμοποιηθούν σύγχρονές τεχνικές MS και η ανοσοενζυμική μέθοδος ELISA. Συγκεκριμένα, ο έλεγχος της καθαρότητας και του μοριακού βάρους των υλικών αναφοράς (reference standards) που θα χρησιμοποιηθούν για mEL (πρωτεΐνες) και MRM (πεπτίδια), θα πραγματοποιηθεί με την χρήση τεχνικών MS που περιλαμβάνει ανάλυση με:
-
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) σε συνδυασμό με αναλυτή χρόνου πτήσης (Time-Of-Flight MS),
-
Υγρή χρωματογραφία νανό-ροής υψηλής ευκρίνειας συζευγμένη μέσω ηλεκτροψεκασμού με υβριδική φασματομετρία μάζας υψηλής ευκρίνειας, ευαισθησίας και ταχύτητας (nLC-ESI-LTQ-Orbitrap), και
-
την νέα τεχνολογία αιχμής OmnitrapMS (top-down MS) την οποία θα αναπτύξει η εταιρεία Fasmatech.
Οι μέθοδοι αυτοί επιτρέπουν την ακριβή και αξιόπιστη αναγνώριση και χαρακτηρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών, ενώ η προετοιμασία του δείγματος και η ανάλυση των αποτελεσμάτων είναι εύκολες και γρήγορες διαδικασίες.
Η αλληλουχία των αμινοξέων και η παρουσία μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων θα ελεγχθεί με τη συνδυαστική χρήση bottom-up και top-down μεθόδων MS. Πιο συγκεκριμένα για την μέθοδο bottom-up ανάλυσης πεπτιδίων και πρωτεϊνών θα χρησιμοποιηθεί πλατφόρμα OrbitrapMS η οποία παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία και επιτρέπει τον εντοπισμό των θέσεων μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Παράλληλα, για τη μέθοδο top-down θα χρησιμοποιηθεί η τεχνολογία αιχμής OmnitrapMS για τον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών αναφοράς. Τέτοιες τροποποιήσεις είναι σημαντικό να ανιχνευθούν καθώς μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά την απόδοση των τεχνικών μέτρησης βιοδεικτών.
Τα reference standards τα οποία ικανοποιούν τα κριτήρια των ελέγχων θα επιλεχθούν για τη βαθμονόμηση (calibration) των οργάνων που θα χρησιμοποιηθούν στη μέτρηση των πιθανών βιοδεικτών. Τα υλικά αναφοράς των mEL και MRM θα χαρακτηριστούν με βάση τις πρότυπες καμπύλες. Η δημιουργία των πρότυπων καμπυλών είναι απαραίτητη για την αξιολόγηση των υλικών αναφοράς και τη μετέπειτα αξιολόγηση του πρωτεϊνικού πάνελ.
Βασικό μέρος του προτεινόμενου έργου αποτελεί η αξιολόγηση των μεθόδων MRM και mEL όσον αφορά την επαναληψιμότητα και την ειδικότητα των αποτελεσμάτων που παράγουν, ώστε να πληρούν τις προδιαγραφές για την επιβεβαίωση των πιθανών βιοδεικτών, την απόλυτη ποσοτικοποίησή τους στο πλάσμα και τη μετέπειτα χρήση τους στην κλινική πρακτική. Και οι δύο τεχνικές εμφανίζουν το πλεονέκτημα της ταυτόχρονης ποσοτικοποίησης πολλών πρωτεϊνών σε ένα κλινικό δείγμα με μεγάλη ειδικότητα.
Τεχνική MRM
H τεχνική ΜRM είναι μια νέα πρωτεωμική μέθοδος που έχει την ικανότητα ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε βιολογικά δείγματα. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται με μεγάλη αποτελεσματικότητα σε συνδυασμό με την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης και αξιοποιεί τη μοναδική ικανότητα των φασματογράφων μάζας που αποτελούνται από τρία τετράπολα να ανιχνεύουν επιλεκτικά τα πεπτίδια συγκεκριμένων προεπιλεγμένων μορίων. Μάλιστα, η MRM ήδη χρησιμοποιείται στην κλινική πρακτική για τη διάγνωση κακοηθών πνευμονικών όγκων με τη μέτρηση εφτά συγκεκριμένων πρωτεϊνών στο πλάσμα (PMID: 24132637).
Τεχνική Multiplex ELISA
Η τεχνική mEL είναι μια ανοσοενζυμική μέθοδος η οποία επιτρέπει την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση πολλών πρωτεϊνών με υψηλή ευαισθησία, σε λιγότερο χρόνο, με χαμηλότερο κόστος και λιγότερο απαιτούμενο όγκο δείγματος, σε σύγκριση με την κλασική τεχνική ELISA. Ακόμη, με mEL είναι δυνατή η άμεση σύγκριση των επιπέδων των αναλυόμενων πρωτεϊνών (PMID:18772478). Εξαιτίας της πολυπλοκότητας του πρωτεώματος οι 2 τεχνικές μπορούν να παρέχουν συμπληρωματικές πληροφορίες με κάποιες πρωτεϊνες να ανιχνεύονται πιο αποτελεσματικά με τη μία σε σχέση με την άλλη τεχνική. Η προσέγγιση που προτείνουμε παρέχει τη μοναδική ευκαιρία οι 2 τεχνικές να χρησιμοποιηθούν παράλληλα και συμπληρωματικά για τη διάγνωση και πρόγνωση μιας πολυπαραγοντικής νόσου η οποία απαιτεί τη χρήση συνδυασμού βιοδεικτών για τον αξιόπιστο χαρακτηρισμό της.