Fasmatech

Βελτιστοποίησης και αξιολόγηση του πρωτοποριακού φασματογράφου μάζας Omnitrap

Στα πλαίσια του προγράμματος mELISA σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε μια νέα παγίδα ιόντων omnitrap με βελτιωμένα χαρακτηριστικά για την πληρέστερη ανάλυση μορίων  χρησιμοποιώντας νέες μεθόδους διάσπασης. Από τις διαφορετικές τεχνικές διάσπασης που είναι διαθέσιμες στην πλατφόρμα omnitrap, επιλέχθηκε η βελτιστοποίηση του μηχανισμού διάσπασης πεπτιδίων με ενεργητικά ηλεκτρόνια, καθώς αυτή δημιουργεί πολλαπλά κανάλια διάσπασης των μορίων και αποτελεί δυνητικά μια βελτιωμένη μέθοδο αναγνώρισης μορίων, ειδικά για ιόντα με χαμηλό αριθμό φορτίων όπου ο μηχανισμός διάσπασης βασισμένος σε συγκρούσεις με αδρανή άτομα δεν εφαρμόζεται με μεγάλη επιτυχία και η πληροφορία για την αλληλουχία των αμινοξέων είναι σχετικά περιορισμένη. Πιο συγκεκριμένα, σχεδιάστηκε εξ ολοκλήρου η πηγή των ηλεκτρονίων και τα οπτικά αυξάνοντας το διαθέσιμο ρεύμα εντός της παγίδας, σχεδιάστηκε νέα γεννήτρια ραδιοσυχνοτήτων για την παγίδευση των μορίων με μεγαλύτερη απόδοση και ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκαν μια σειρά από αλλαγές στο FPGA, στην γεννήτρια σημάτων που οδηγούν την παγίδα αυξάνοντας την ευελιξία στον σχεδιασμό πειραμάτων φασματομετρίας μάζας πολλαπλών σταδίων (tandem MS). Τέλος, βελτιώθηκε το γραφικό περιβάλλον διεπαφής και αναπτύχθηκαν νέες ρουτίνες για την διάσπαση των μορίων. Παράλληλα με την μελέτη της διάσπασης πεπτιδίων με ενεργητικά ηλεκτρόνια που βρίσκει εφαρμογή σε μεθόδους bottom-up, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις και με ολόκληρες πρωτεϊνες (top-down), πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε η πρωτείνη ουμπικουιτίνη (ubiquitin) και μελετήθηκαν οι μηχανισμοί διάσπασης χρησιμοποιώντας ηλεκτρόνια χαμηλής ενέργειας καθώς και ενεργητικά ηλεκτρόνια, επιτυγχάνοντας πλήρη κάλυψη της αλληλουχίας των αμονιξέων

IIBEAA

Αποτελέσματα ελέγχου καθαρότητας και μοριακού βάρους των υλικών αναφοράς που θα χρησιμοποιηθούν για MRM, και χαρακτηρισμός τους με βάση τις πρότυπες καμπύλες  (reference standards)

Από τις 39 πρωτεΐνες οι οποίες ήταν ενδιαφέρουσες ως πιθανοί βιοδείκτες της ΧΝΝ (Glorieux et al.) [1], οι 31 διέθεταν πρωτεοτυπικά πεπτίδια σύμφωνα με το Skyline. Με βάση αυτές τις πληροφορίες, ελήφθησαν 39 SIS πεπτίδια που αντιστοιχούσαν σε 31 πρωτεΐνες (1 πρωτεοτυπικό πεπτίδιο ανά πρωτεϊνη πλην των TFAM, B2M, PRPF3, LYZ, CNNM4, ITPR1, LENG8 και PTGDS με 2 πρωτεοτυπικά πεπτίδια για την κάθε μία). 6 πρωτεοτυπικά πεπτίδια που αντιστοιχούσαν σε 6 πρωτεΐνες επιλέχτηκαν για περαιτέρω αναλυτικό έλεγχο. Tα παραπάνω πεπτίδια παρουσίαζαν εξαιρετικά και πανομοιότυπα χρωματογραφικά προφίλ τόσο στο ενδογενές ΝΑΤ όσο και στο SIS (ταυτόχρονη έκλουση SIS και NAT) καθώς και συμμετρικά σχήματα κορυφής. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια της μεθοδολογίας ΜALDI-TOF MS εκτιμήθηκε η καθαρότητα των 6 συνθετικών πεπτιδίων αναφοράς SIS για τις 6 επιλεγόμενες πρωτεΐνες στόχους (IGHA1, HBB, SERPINF1, AMBP, B2M, LYZ). Η υψηλότερη κορυφή για το κάθε πεπτίδιο στόχο, αντιστοιχεί στο αναμενόμενο μοριακό βάρος του πεπτιδίου. 

Ακολούθησε η δημιουργία πρότυπων καμπυλών για τα πεπτίδια SIS. Το R2 των πρότυπων καμπυλών ήταν > 0.99 για όλα τα πεπτίδια, εκτός από την Β2Μ που ήταν > 0.97. Η εκτίμηση της ακρίβειας της ποσοτικοποίησης πραγματοποίηθηκε σε όλα τα σημεία της καμπύλης και στα περισσότερα τα CVs ήταν <20% σύμφωνα με τα κριτήρια του FDA. Συνοπτικά,  λόγω διαθεσιμότητας πρωτεοτυπικών πεπτιδίων αναφοράς καθώς και ανιχνευσιμότητας του βαρέου προτύπου (SIS-Stable Isotope Labeled Standard) ή του ενδογενούς (NAT-endogenous or native) πεπτιδίου καταλήξαμε σε 6 πεπτίδια που αντιστοιχούν σε 6 πρωτεΐνες. 

Στην συνέχεια,  πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση σε αντιπροσωπευτικά δείγματα ΧΝΝ (Ν=8) διαφορετικών σταδίων (ΧΝΝ σταδίου 2 Ν=2, XNN σταδίου 3 Ν=2, XNN σταδίου 4 Ν=2, ΧΝΝ σταδίου 5 Ν=2). Η συγκέντρωση του SIS πεπτιδίου που προστέθηκε σε κάθε δείγμα επιλέχθηκε βάση δημοσιευμένων ποσοτήτων των αντίστοιχων πρωτεινών. Σε κάθε περίπτωση το εύρος των τιμών που μετρήθηκαν ήταν εντός των ορίων της καμπύλης. 

ProtATonce

Επιλογή των βέλτιστων πρωτεϊνών αναφοράς, με Orbitrap, Omnitrap, και με τη δημιουργία πρότυπων καμπυλών για M-ELISA

Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις σε 79 δείγματα πλάσματος με χρήση multiplex assay για 19 κυτταροκίνες. Η προεργασία των δειγμάτων και η ανάπτυξη του multiplex assay έγιναν βάσει καθιερωμένων πρωτοκόλων της PROTATONCE Ltd. Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν σε τριπλότυπα, συμπεριλαμβανομένου του τυφλού της μέτρησης. 

Τα αποτελέσματα του QC φανερώνουν πολύ καλή επαναληψιμότητα των μετρήσεων, με χαμηλό σφάλμα μέτρησης ανάμεσα στα τριπλότυπα και μικρή απώλεια δειγμάτων λόγων bead count. Συνεπώς η πειραματική διαδικασία που ακολουθείται είναι αποτελεσματική για τη μέτρηση πρωτεϊνών σε πλάσμα αίματος.

Από τις 19 πρωτεϊνες που μετρήθηκαν, οι 4 αποκλείστηκαν απο περαιτέρω αναλύσεις λόγω χαμήλου σήματος έναντι του θορύβου που δημιουργεί ο διαλύτης των πρωτεϊνών (background). Γι αυτές τις πρωτεϊνες θα πρέπει να βρεθούν άλλα αντισώματα και να απαναληφθεί η διαδικασία του assay development. 

IMBB - ITE

Έλεγχος του μοριακού βάρους και της αλληλουχίας αμινοξέων των υλικών αναφοράς (reference standards) που θα χρησιμοποιηθούν για MRM (πεπτίδια)

Στα πλαίσια του προγράμματος mELISA πραγματοποιήθηκε έλεγχος του μοριακού βάρους και της αλληλουχίας αμινοξέων των υλικών αναφοράς (reference standards) που θα χρησιμοποιηθούν για MRM (πεπτίδια), με την χρήση τεχνικών φασματομετρίας μάζας πολλαπλών σταδίων (MS και MS/MS) που περιλαμβάνουν ανάλυση με υγρή χρωματογραφία νανό-ροής υψηλής ευκρίνειας συζευγμένη μέσω ηλεκτροψεκασμού με υβριδικό φασματόμετρο μάζας υψηλής ευκρίνειας, ευαισθησίας, ταχύτητας και ακρίβειας (nLC-ESI-MS/MS, Orbitrap). Προσδιορίστηκε με ακρίβεια η σύσταση του πετπιδικού μείγματος, ταυτοποιήθηκαν τα πεπτίδια και οι αντίστοιχες πρωτεΐνες με βάση την ακριβή τους μάζα και την αλληλουχία αμινοξέων τους, και ελέχθησαν το προφίλ θραυσματοποίησης και τα παραγώμενα θραύσματα που θα χρησιμοποιηθούν για MRM.

Follow

©2020 by www.m-elisa.org/ Proudly created with Wix.com

This site was designed with the
.com
website builder. Create your website today.
Start Now