Από τις 39 πρωτεΐνες οι οποίες ήταν ενδιαφέρουσες ως πιθανοί βιοδείκτες της ΧΝΝ (Glorieux et al.) [1], οι 31 διέθεταν πρωτεοτυπικά πεπτίδια σύμφωνα με το Skyline. Με βάση αυτές τις πληροφορίες, ελήφθησαν 39 SIS πεπτίδια που αντιστοιχούσαν σε 31 πρωτεΐνες (1 πρωτεοτυπικό πεπτίδιο ανά πρωτεϊνη πλην των TFAM, B2M, PRPF3, LYZ, CNNM4, ITPR1, LENG8 και PTGDS με 2 πρωτεοτυπικά πεπτίδια για την κάθε μία). 6 πρωτεοτυπικά πεπτίδια που αντιστοιχούσαν σε 6 πρωτεΐνες επιλέχτηκαν για περαιτέρω αναλυτικό έλεγχο. Tα παραπάνω πεπτίδια παρουσίαζαν εξαιρετικά και πανομοιότυπα χρωματογραφικά προφίλ τόσο στο ενδογενές ΝΑΤ όσο και στο SIS (ταυτόχρονη έκλουση SIS και NAT) καθώς και συμμετρικά σχήματα κορυφής. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια της μεθοδολογίας ΜALDI-TOF MS εκτιμήθηκε η καθαρότητα των 6 συνθετικών πεπτιδίων αναφοράς SIS για τις 6 επιλεγόμενες πρωτεΐνες στόχους (IGHA1, HBB, SERPINF1, AMBP, B2M, LYZ). Η υψηλότερη κορυφή για το κάθε πεπτίδιο στόχο, αντιστοιχεί στο αναμενόμενο μοριακό βάρος του πεπτιδίου. 

Ακολούθησε η δημιουργία πρότυπων καμπυλών για τα πεπτίδια SIS. Το R2 των πρότυπων καμπυλών ήταν > 0.99 για όλα τα πεπτίδια, εκτός από την Β2Μ που ήταν > 0.97. Η εκτίμηση της ακρίβειας της ποσοτικοποίησης πραγματοποίηθηκε σε όλα τα σημεία της καμπύλης και στα περισσότερα τα CVs ήταν <20% σύμφωνα με τα κριτήρια του FDA. Συνοπτικά,  λόγω διαθεσιμότητας πρωτεοτυπικών πεπτιδίων αναφοράς καθώς και ανιχνευσιμότητας του βαρέου προτύπου (SIS-Stable Isotope Labeled Standard) ή του ενδογενούς (NAT-endogenous or native) πεπτιδίου καταλήξαμε σε 6 πεπτίδια που αντιστοιχούν σε 6 πρωτεΐνες. 

Στην συνέχεια,  πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση σε αντιπροσωπευτικά δείγματα ΧΝΝ (Ν=8) διαφορετικών σταδίων (ΧΝΝ σταδίου 2 Ν=2, XNN σταδίου 3 Ν=2, XNN σταδίου 4 Ν=2, ΧΝΝ σταδίου 5 Ν=2). Η συγκέντρωση του SIS πεπτιδίου που προστέθηκε σε κάθε δείγμα επιλέχθηκε βάση δημοσιευμένων ποσοτήτων των αντίστοιχων πρωτεινών. Σε κάθε περίπτωση το εύρος των τιμών που μετρήθηκαν ήταν εντός των ορίων της καμπύλης.