ProtATonce

 

Επιλογή των βέλτιστων πρωτεϊνών αναφοράς, με Orbitrap και Omnitrap, καθώς και με τη δημιουργία πρότυπων καμπυλών για m-ELISA

1. Τεχνική m-ELISA (mEL)

Η τεχνική mEL είναι μια ανοσοενζυμική μέθοδος η οποία επιτρέπει την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση πολλών πρωτεϊνών σε ένα δείγμα με υψηλή ευαισθησία, σε λιγότερο χρόνο, με χαμηλότερο κόστος και λιγότερο απαιτούμενο όγκο δείγματος, σε σύγκριση με την κλασική τεχνική ELISA. Ακόμη, με mEL είναι δυνατή η άμεση σύγκριση των επιπέδων των αναλυόμενων πρωτεϊνών (PMID:18772478). 
Στην τεχνική mEL, οι πρωτεομικές μετρήσεις πραγματοποιούνται χρησιμοποιοώντας την τεχνολογία xMAP της Luminex (USA). Εν συντομία, το σύστημα Luminex xMAP 3D έχει τη δυνατότητα να ανιχνεύει πολλές πρωτεϊνες-στόχους σε ένα βιολογικό δείγμα χρησιμοποιώντας μεθόδους ανοσοεντοπισμού σε μικροσφαιρίδια (beads). Βασίζεται στη χρήση παραμαγνητικών beads ή beads πολυεστυρενίου τα οποία είναι ενδογενώς σημασμένα με ερυθρά και υπέρυθρα φθοροφόρα διαφορετικών εντάσεων. Σε κάθε bead έχει δωθεί μια μοναδική αρίθμηση (bead region) επιτρέπωντας έτσι το διαχωρισμό μεταξύ αυτών, το συνδυασμό και την ταυτόχρονη χρήση διαφορετικών beads με διαφορετικούς στόχους στο ίδιο δείγμα. Πρωτεϊνες, όπως αντισώματα, συνδέτες αλλά και νουκλεικά οξέα ειδικά για τον προς μέτρηση στόχο  (αναλύτες)  μπορούν να προσδεθούν στα beads. Το σύστημα Luminex xMAP 3D χρησιμοποιεί ένα διπλό σύστημα laser που εντοπίζει τόσο το σήμα ενδογενούς φθορισμού κάθε bead όσο και την παρουσία ή απουσία του δείκτη αναφοράς (reporter) του πρωτεϊνικού στόχου. Η ένταση φθορισμού του reporter υπολογίζεται βάσει της μέσης τιμής όλων των beads με όμοιο bead region, εξάγοντας πληροφορίες τόσο για την ταυτότητα του κάθε bead όσο και για τη ένταση φθορισμού των πρωτεϊνικών στόχων στο δείγμα. 
Η τεχνική mEL βασίζεται στην κλασσική sandwich ELISA, όπου αντίσωμα ειδικό για την προς μέτρηση πρωτεϊνη (capture antibody) ακινοτοποείται σε μια επιφάνεια, συνήθως πλάκες καλλιέργειας πολυεστυρενίου, και επωάζεται με το δείγμα που περιέχει την πρωτεϊνη-στόχο. Στη συνέχεια προστίθεται ένα δεύτερο αντίσωμα εντοπισμού (detection antibody) σημασμένο με φθορίζων μόριο ή μόριο που παράγει ηλεκτροχημικό σήμα, ειδικό για έναν διαφορετικό επίτοπο της πρωτεϊνης στόχου. Η παρουσία και η συγκέντρωση της πρωτεϊνης στόχου καθορίζονται από την οπτική απορόφηση ή το ηλεκτροχημικό σήμα που παράγει το αντίσωμα εντοπισμού.
Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στη mEL αρχικά καθαρίζονται από ρυθμιστικά διαλύματα που περιέχουν αμίνες αλλά και από πρωτεϊνες φορείς που μπορεί να παρεμβαίνουν με τη διαδικασία πρόσδεσης στα beads. Τα capture antibodies προσδένονται στα μαγνητικά beads ενώ τα detection antibodies βιοτυνυλιώνονται. Τόσο η πρόσδεση σε beads όσο και η βιοτυνυλίωση διαπιστώνονται με πρωτόκολλα ποιοτικού ελέγχου. Σε κάθε πολυπλεκτική μέθοδο (assay) που κατασκευάζεται, τα καταλληλότερα ζέυγη capture/detection αντισωμάτων επιλέγονται τόσο βάσει της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας μεταξύ τους όσο και  βάσει του λόγου σήματος/θορύβου (signal-to-noise ration; SNR).
Κάθε μέτρηση περιλαμβάνει τη μέση τιμή της έντασης φθορισμού κάθε πρωτεϊνης στόχου που  υπολογίζεται βάσει της μέσης τιμής όλων των beads με όμοιο bead region (median fluorescent intensity; MFI), καθώς και το πλήθως των beads με όμοιο bead region (bead count).

​

2. Ποιοτικός έλεγχος mEL (QC) 

Οι πρωτεομικές μετρήσεις είναι αποδεκτές αν ακολουθούν τα παρακάτω κριτήρια:

• Bead Counts QC: Η μέτρηση είναι αποδεκτή αν η αντίστοιχη μέτρηση πλήθους των beads είναι μεγαλύτερη του 30.

• Replicate QC: Η μέτρηση είναι αποδεκτή αν είναι είναι έως 3 φορές μικρότερη από τη μέση απόλυτη απόκλιση από τη μέση τιμή των μετρήσεων MFI όλων των τριπλότυπων μετρήσεων.  

• Analyte distribution QC: Η μέτρηση είναι αποδεκτη αν είναι έως 3 φορές μικρότερη από την τυπική απόκλιση της μέσης τιμής MFI του αναλύτη.

 

3. Πρότυπες καμπύλες για υπολογισμό συγκέντρωσης πρωτεϊνης (ng/mL) βάσει του MFI

 

3.1 Επιλογή πρωτεϊνών για την κατασκευή καμπυλών αναφοράς

H ProtATonce αναπτύσσει βιοδείκτες για ΧΝΝ σε συνεργασία με το Πανεπιστήμιο του Harvard και χρηματοδότηση από το NIH/NIDDK (National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases). Η ανάπτυξη βιοδεικτών βασίζεται σε βιοπληροφορικές αναλύσεις που συνδυάζουν ανάλυση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης ασθενών με XNN και δεδομένα από τις διαθέσιμες βάσεις δεδομένων για την κατασκευή βιολογικών μοντέλων και την εξαγωγή πληροφορίας για την μοριακό μηχανισμό της νόσου. Συγκεκριμένα, πρόσφατα αναπτύχθηκε μια τέτοια πλατφόρμα, ικανή να αναγνωρίζει μοριακες υπογραφές που επιτρέπουν τόσο την αξιολόγηση σταδίων της νόσου όσο και την ανάδειξη ενός προτεινόμενου μηχανισμού επαγωγής αυτών. Η πλατφόρμα αυτή χρησιμοποιεί δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνων-πρωτεϊνών σε συνδυασμό με δεδομένα γονιδιακής έκφρασης σαν βάση γνώσης του βιολογικού μηχανισμού της ΧΝΝ. Στη συνέχεια, συνδυάζει αυτά με μεταγραφικά δεδομένα της νόσου για να σχηματίσει ένα νοσο-ειδικό μοντέλο. Τέλος, το μοντέλο αυτό αναλύεται χρησιμοποιώντας μεθόδους τελευταίας τεχνολογίας (π.χ. ανάλυση δικτύων, ανάλυση μονοπατιών) που σχηματίζει ένα μοριακό προφίλ για κάθε πρωτεϊνη. Η πλατφόρμα αυτή μέχει στιγμής αναδεικνύει ως ικανούς βιοδείκτες τις πρωτεϊνες  Galectin-3, ICAM1 και MMP9, γεγονός που επιβεβαιώνεται και από βιβλιογραφικά δεδομένα. Οι πρωτεϊνες αυτές χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή πρότυπων καμπυλών αναφοράς.

 

3.2 Πρωτόκολλο κατασκευής πρότυπων καμπυλών αναφοράς – Πειραματική διαδικασία

Οι πρότυπες καμπύλες αναφοράς επιτρέπουν την μετατροπή των τιμών MFI σε τιμές συγκέντρωσης πρωτεϊνης (ng/mL). Για τον σκοπό αυτό λήφθηκαν ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες Galectin-3, ICAM1 και MMP9 και παρασκευάστηκαν διαλύματα τελικής συγκέντρωσης 50ng/mL. Στη συνέχεια τα διαλύματα αραίωθηκαν περαιτέρω σε 15 3x σειριακές αραιώσεις, σε ρυθμιστικό διάλυμα Low cross normal buffer (CANDOR), συμπεριλαμβανομένου του αρνητικού μάρτυρα για το πείραμα (negative  control – 0ng/mL).
Τα capture και detection αντισώματα συνδέθηκαν σε μαγνητικά beads και βιοτυνυλιώθηκαν αντίστοιχα, με την πειραματική διαδικασία που περιγάφεται παραπάνω. Τα capture antibodies/beads και τα βιοτυνυλιωμένα detection antibodies αναμείχθηκαν και κατασκευάστηκε το bead mix και το detection mix αντίστοιχα. 50μL από το bead mix επωάστηκαν με τις αραιώσεις των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε πλάκες καλλιέργειας 96 θέσεων (96-well plates) για 90 λεπτά σε 900rpm και θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προστέθηκε το detection mix και τα δείγματα επωάστηκαν για 60 λεπτά σε 900rpm και θερμοκρασία δωματίου. Τέλος προστέθηκε φρέσκο διάλλυμα SAPE (Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate, Cat Nr: S866, Invitrogen), και μετά από 15 λεπτά επώαση, τα δείγματα μετρήθηκαν με το σύστημα Luminex FlexMAP 3D. 
Όλες οι μετρήσεις για τις ανασυνδυασμένες πρωτείνες, το negative control και το τυφλό (blank) πραγματοποιήθηκαν σε τριπλότυπα (triplicates). Βάσει της γνωστής συγκέντρωσης κάθε πρωτεϊνης και των μονάδων MFI που λήφθηκαν, κατασκευάστηκαν οι πρότυπες καμπύλες για κάθε πρωτεϊνη ακολουθώντας συγκεκριμένα βήματα και πληρώντας προϋποθέσεις.

​

​

 

 

Τα αποτελέσματα της ανάπτυξης των τριών μεθόδων (assays) που αναπτήχθηκαν για μέτρηση των πρωτεϊνών Galectin-3, ICAM1 και MMP9  αντίστοιχα, παρουσιάζονται παρακάτω. 

• Bead counts QC: Καμία από τις μετρήσεις δεν εμφάνισε count μικρότερο του 30 (min = 100). 

• Εντοπισμός ακραίων τιμών: 17 πειραματικά αντίγραφα (11.11% of the total) αναγνωρίστηκαν ως ακραίες τιμές και αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση.  

• Limit of Blank (LoB): Τα LoB για κάθε πρωτεΪνη παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

​

Πίνακας 1 - Limit of Blank (LoB). Για κάθε μέθοδο παρουσιάζονται ο μέσος όρος των πειραματικών αντιγράφων της συγκέντρωσης 0 (μb), η τυπική τους απόκλιση (σb) και το LoB.

​

 

 

 

 

 

 

 

 

• Limit of Detection (LoD): Τα LoD για κάθε assay παρουσιάζονται στον πίνακα 2. 

Πίνακας 2 - Limit of Detection (LoD). Για κάθε μέθοδο παρουσιάζονται, το πλήθος των σημείων δεδομένων στο εύρος χαμηλής συγκέντρωση Nlc, η τυπική τους απόκλιση (σlc), ο συντελεστής τους (Cb) και το LoD.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

• Επιλογή εύρους βαθμονόμησης (calibration range): Το εύρος συγκεντρώσεων που επιλέχθηκε για την δημιουργία πρότυπων καμπυλών για κάθε πρωτεϊνη παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Η Εικόνα 1 επικονίζει τις ημι-λογαριθμηκές καμπύλες συσχέτισης συγκέντρωσης και MFI για κάθε assay. 

Πίνακας 3 – Έυρος βαθμονόμησης. Για κάθε  assay παρουσίαζονται οι ελάχιστες (lowConcentration) και οι μέγιστες (highConcentration) συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευώ των πρότυπων καμπυλών. 
 

​

​

​

​

.
 

 

 

Εικόνα 1 – Ημι-λογαριθμικά εύρη βαθμονόμησης. Για κάθε assay, το MFI απεικονίζεται ως ο δεκαδικός λογάριθμος (log10) της συγκέντρωσης

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

• Ακρίβεια επαναληψιμότητας μετρήσεων: Κανένα από τα πειραματικά αντίγραφα δεν εμφάνισε συντελεστή μεταβλητότητας μεγαλύτερο του 25% (max = 22.32%) συνεπώς καμία μέτρηση δεν αποκλείστηκε λόγω αυτού. 

• Κατασκευή πρότυπων καμπυλών: Οι πρότυπες καμπύλες που κατασκευάστηκαν απεικονείζονται στην Εικόνα 2. Στον Πίνακα 4 παρουσίαζονται οι τιμές των παραμέτρων που περιγράφουν τις καμπύλες 5PL. 

​

Πίνακας 4 – Συντελεστές λογιστικού μοντέλου παλινδρόμησης 5PL για κάθε assay. A: κατώτερη ασύμπτωτη, B: Συντελεστής Hill’s, C: Σημείο καμπής, D: Μέγιστη ασύμπτωτη, E: Συντελεστής ασυμμετρίας..
 

​

​

​

​

​

​

 

 

Εικόνα 2 –Πρότυπες Καμπυλες. A) Galecting.3, B) ICAM1, C) MMP9. Ο άξονας  y αφορά τις τιμές  MFI and (left) και τις κανονικοποιημένεες τιμές MFI. Ο άξονας x αφορά τις συγκεντρώσεις (ng/ml) σε κλίμακα  log10. Το GOF αντιπροσωπεύει την ποιότητας της παρεμβολής των μετρήσεων στο μοντέλο 5PL (goodness of fit).

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

  
 

​

​

​

 

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

​

• Ποιοτικός έλεγχος: Στον Πίνακα 5 παρουσιάζονται τόσο η ευαισθησία των assays (A), όσο και τα LoB και LoD σε μονάδες συγκέντρωσης (ng/ml).

​

Πίνακας 5- Ευαισθησία των assays. Παρουσιάζονται τα LoB, LoD, και η ευαισθησία για κάθε assay.
 

 

 

 

 

 

​

​